白癜风的转化研究

白癜风是一种以出现白斑为特征的皮肤疾病。在过去的30年里,人们在了解白癜风发病机制方面取得了重大进展。早期有神经支配、微血管异常、氧化应激、黑素细胞粘附缺陷、自身免疫、体细胞镶嵌和遗传作用等假说。由于有关发病机制的理论推动了实验设计和。动物模型使研究人员能够进行机制研究,而改进的患者样本收集方法的为白癜风的转化研究提供了一个平台,也可以应用于了解其他在人类样本中更难以研究的自身免疫性疾病。在此,我们讨论了白癜风转化研究的历史,最近的进展,以及它们对新的治疗的影响

白癜风的早期研究

过去的30年里,白癜风的研究激增。以白癜风为题材发表的科学论文呈指数级增长(图1),并在开发新的靶向治疗方法方面取得了重大进展。

 

图1.Pubmed有关白癜风的研究呈指数增长。
图1.Pubmed有关白癜风的研究呈指数增长。

3500年前就有白癜风及其治疗方法的记载。这些古代文献描述了白癜风的表现,郑重介绍了白癜风相关歧视,当时治疗方法。白癜风患者仍存在古印度和佛教著作中所记载的社会歧视,包括限制结婚。这些古文献中提到的大多数治疗方法,如涂抹大象粪便或摄取眼镜蛇的骨头,目前都已弃用。

然而,有一种方法的治疗至今仍在使用。约公元前1400年的古印度医学文献Atharvaveda记载,白癜风患者被咀嚼Bavachi(Psoralea corylifolia)植物的黑色种子,然后午后阳光照射直至出汗,暴露的皮肤会出现水疱性晒伤。后来发现该植物含有补骨脂素。虽然按照今天的标准,这种治疗方法是不可接受的,但在古代该法很可能是最有效的,因此古代一直使用。20世纪中期还重新使用该方法,即PUVA疗法,局部或口服补骨脂素衍生物联合UVA光治疗。

现代医学文献对白癜风的记载已有100多年的历史。早期文献主要是案例报道,描述临床观察及其与其他疾病的相关性。描述白癜风为皮肤斑块状脱色,始发白色斑点,随着时间的推移逐渐增加成较大的斑片,毛发常不出现脱色。白癜风患者常伴发其他自身免疫性疾病,如斑秃、1型糖尿病和阿狄森氏病等。有文献记载使用砷、硫、汞、锑和硫酸治疗白癜风,这些方法由于疗效差副作用大而不再使用。比如用硫酸腐蚀烧蚀皮损,这样白斑就因为疤痕和/或色素沉着而不明显。

20世纪40年代,人们才对白癜风进行了更深入研究。1947年Haxthausen将白癜风正常皮肤移植到白斑区,可使白斑出现不同复色;将白斑移植到正常皮肤,则可使移植部位出现脱色。他推测,可能由神经系统决定的局部环境在起作用。Comel在1948年使用带蒂皮瓣和管状皮瓣治疗白癜风取得类似结果。Spencer和Tolmach在1951年发现病变和非病变皮肤之间的移植没有导致上述的复色或脱色结果,但发现白斑区在移植周围出现白斑。导致上述结果不一致的可能原因是皮肤移植方法不同。Haxthausen使用薄层皮片移植,称为Thiersch移植,而Spencer和Tolmach使用全厚皮肤移植。尽管这些都是小样本的案例研究,但表明移植的局部环境是一个重要的因素。1964年,Behl使用Thiersch移植技术大规模治疗稳定期白癜风患者,取得了较好的疗效。

白癜风的发病机制

白癜风的发病机制有许多假设,如神经支配、微血管异常、氧化应激引起的黑素细胞退化、黑素细胞粘附缺陷、自身免疫、体细胞镶嵌和遗传(图2)。

图2. 白癜风发病机制假说
图2. 白癜风发病机制假说。(A) 神经假说:皮肤内的神经元释放神经肽,如儿茶酚胺,作用于黑素细胞,导致脱色。(B) 微血管理论:白癜风皮损血流增加,使淋巴细胞浸润增加,导致黑色素细胞的自身免疫攻击。(C) 体细胞嵌合:脱色症的发生是因为黑色素细胞的体细胞突变,容易受到自身免疫的攻击。(D) 黑色素细胞粘附:黑素细胞或角质细胞的摩擦或氧化应激导致黑素细胞与皮肤的粘附力降低而消失。(E) 退行性理论:色素沉着的发生是由于黑素细胞的内在缺陷,如对环境应激的敏感性增加和活性氧化物种(ROS)的失调。 (F) 自身免疫理论:自体免疫细胞攻击和杀死黑素细胞,最终导致色素沉着。(G) 基因:导致白癜风的所有途径的基础。神经(A)和微血管理论(B)得到的支持最少,呈灰色。图由BioRender.com创建。

神经理论

神经支配影响脱色的假说,通常称为 「神经假说」,主要是基于一些基本上没有得到支持的观察。

  1. 节段型白癜风是单侧的,然而,皮损很少局限于一个皮节,而常常跨越多个皮节。
  2. Lerner假设白癜风是由神经元释放的神经肽增加引起的,导致黑素细胞的黑色素生成减少。也有报道称白癜风患者的尿液中儿茶酚胺升高,导致一些人认为这来自于功能失调的神经元。然而,有人对这些结果提出异议,并指出儿茶酚胺黑色素细胞也可产生。因此,这些研究并没有将神经与疾病的发病机制联系起来。
  3. 病例报告发现白癜风首先发生神经创伤受损的肢体,但事实也恰恰相反,有报告说无神经的肢体重新复色或完全不患白癜风。大多数情况下神经支配并不影响白癜风。因此这些不一致的病例报道更可能是偶然现象。
  4. 有报道称病变部位的出汗和血管收缩发生了改变。然而也有相互矛盾的报道。有些报告称所有的白癜风皮损都出现胆碱能增加,而另一些报告则称这种观察仅发生在节段性皮损,而非双侧皮损。交感神经张力的报道也是相互矛盾的,一些研究观察到交感神经张力增加,另一些观察到交感神经张力下降。这些研究在很大程度上是不确定的,因此,认为它们作为白癜风发病机制提供见解还为时过早。
  5. 压力或创伤似乎会加剧白癜风的病情。这通常被认为是由于神经体液调节导致,然而目前没有证据支持神经元的参与。许多自身免疫性疾病因应激而加重,这种疾病也没发现有神经元参与。
  6. 动物研究发现鱼类神经控制色素沉着。然而,哺乳动物特别是人类,没有证据表明这一点。
 因此「神经假说」现在支持较少。

微血管理论

微血管理论认为,节段型白癜风进入病变皮肤的血流量会增加。节段型白癜风患者皮损处的血流比健康人增加三倍,但在非皮损处的血流则没有增加。后来发现是区域淋巴结中自体活性T细胞的激活进入血液循环。血流的增加可能会淋巴细胞的迁移增加,特别是黑色素细胞特异性的细胞毒性T细胞,因为它们表达皮肤归巢受体,迁移到病变处破坏黑素细胞。

然而矛盾结果是,黑素瘤患者免疫疗法发生白癜风通常以非节段性模式发展。如果微血管理论是真实的,那么应该是起源于注射部位的区域节段模式发展。此外,微血管理论常与神经理论结合在一起,因为有人提出,交感神经受损导致皮肤血管扩张而使血流增加。这一理论缺乏真正的证据。

退行性理论

退行性理论认为黑素细胞存在缺陷,导致在皮肤内消失,从而引起脱色。这一理论源于以下观察结果:白癜风患者的黑素细胞难以培养,而且增殖速度比健康人的黑素细胞慢得多。白癜风患者的黑素细胞中,存在活性氧(ROS)的失调和对诱发ROS的化学物质的敏感性增加。过氧化氢酶是一种将过氧化氢(ROS的来源之一)转化为水的酶,白癜风皮损过氧化氢酶减少。但外用过氧化氢酶药膏治疗黑素细胞的氧化应激,似乎对疾病没有影响。过氧化氢酶联合钙和UVB光治疗可导致有效的复色。然而,Gilhar等人证明病变内黑素细胞仍有功能,将人白癜风皮肤移植到裸鼠后完全复色,而且移植部位的黑素细胞数量增多。因此,尽管有明确的证据表明皮损中的黑素细胞不正常,但是黑素细胞变性不能完全导致白癜风。

黑素细胞粘附理论

黑素细胞粘附理论认为,黑素细胞失去或减少了与皮肤的粘附性,因此在应激或机械压力下黑素细胞易丢失。有研究发现黑素细胞上粘附分子E-cadherin的表达减少,而另一项研究报告了健康人、非病变皮肤和病变皮肤之间粘附分子E-cadherin的表达没有明显差异,但在白癜风病变和非病变皮肤中一种 「抗粘附分子」Tenascin的表达升高,这可能导致皮肤黑素细胞的丢失。需要更多的体内实验数据来确定黑素细胞粘附缺陷在黑素细胞丧失过程中的作用,如敲除小鼠模型中黑素细胞中的粘附分子是否会导致疾病严重程度增加。

角质细胞也可能在黑色素细胞的丧失中发挥作用。角质细胞和黑素细胞组成「表皮黑素单元」,通过旁分泌生长和生存因子维持表皮稳态。白癜风皮损及其周围皮肤的角质细胞氧化应激失调。角质细胞线粒体异常,ROS产生增加,抗氧化剂产生减少,表达凋亡蛋白。角质细胞产生的CXCL9和CXCL10将CD8+T细胞招募到皮肤。因此在白癜风发病过程中,角质细胞缺陷可能导致黑素细胞粘附异常。

但是黑素细胞与角质层细胞的粘附力缺陷可能是自身免疫性炎症的原因,也可能是结果。黑素细胞可能通过大量释放自身抗原而引发自身免疫,也可能在处理应激或自身免疫时因内在缺陷导致粘附力降低。

自身免疫理论

自身免疫理论认为,自身反应的免疫细胞会攻击黑素细胞,导致黑素细胞的死亡,从而引起脱色。这是最早的白癜风理论之一,最初注意到白癜风与其他自身免疫性疾病同时发病,从而暗示了自身免疫的关联。20世纪70年代末,发现白癜风患者中存在针对黑素细胞的自身抗体,而在健康人群没有。将人类皮肤移植到裸鼠身上,然后注射来自白癜风患者的纯化IgG抗体,也可破坏黑素细胞(58)。自身抗体很可能不是疾病的主要驱动因素,因为自身抗体水平与白癜风严重程度并不相关,而且自身抗体平均分布在全身,非集中在病变部位。

黑素细胞的损伤可能是由另一种机制造成的。早期的免疫组化研究注意到病变皮肤内的黑素细胞减少,真皮上部和表皮中存在免疫细胞。皮肤有CD8+T细胞浸润,且位于濒临死亡的黑素细胞附近。因此CD8+T细胞是黑素细胞的充分必要条件。全基因组关联(GWA)研究也支持自身免疫理论,白癜风相关风险基因主要与免疫有关,包括与适应性和先天性免疫反应相关的基因。 

白癜风的黑素细胞产生热休克蛋白以应对细胞应激,从而激活未折叠的蛋白应激反应。这些异常可能导致释放损伤相关分子模式(DAMPs),通过TLR2、TLR4和NLRP炎性小体等模式识别受体(PRR)传导信号。诱导白癜风的化学物质,如苯酚会启动黑素细胞的未折叠蛋白反应(UPR),从而导致IL-6和IL-8的产生,这两种细胞因子促进免疫细胞募集。先天免疫细胞(包括炎性树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞)在白癜风病变皮肤也有浸润。白癜风非皮损区NK细胞增加,表明其在疾病的发生中起作用。这些研究表明,黑素细胞可能通过从炎症信号中募集先天免疫细胞并释放能够通过这些细胞上的病原体识别受体(PRR)发出信号的DAMP来启动先天免疫应答。

遗传学

遗传学影响着白癜风的发病风险。事实上,遗传影响着白癜风的各个方面,如免疫学、黑素细胞的应激和粘附等。白癜风发病率的流行病学和家族学研究,白癜风患病率1%-2%,一级亲属患病的人风险更高。白癜风患者的兄弟姐妹的发病率较高,如果兄弟姐妹是双胞胎,则发病率的增加幅度更大。与父亲相比,白癜风母亲的后代的风险更高。可能是线粒体DNA的遗传,线粒体DNA只能从母亲获得。

最近的GWA研究发现许多免疫相关和黑素细胞特异性基因的小核苷酸多态性(SNPs)。通过GWAS识别的黑色素细胞特异性基因(OCA2-HERC2,PMEL)支持黑素细胞参与发病,而涉及应激和凋亡的基因(SOD2,GSTP1,RERE,XPB1)也支持黑素细胞应激的作用。GWA研究结果证实了自身免疫理论,黑素细胞特异性基因通常是自身抗原(PMEL)和免疫相关基因(FOXP3、GMZB、XPB1)。虽然这些SNP提供了重要的见解,但需要进行功能基因组研究,以了解SNP与疾病发病机制的全面关系。

虽然遗传学在白癜风中明显起作用,但环境暴露和随机事件也是发病机制的因素。同卵双胞胎患白癜风的重合率只有23%-26%,而不是预期的100%。永久性染发剂和化妆品中的化学物质,以及像4-TBP和氢醌的单苯醚这样的化学物质,会诱发和加重白癜风。这些化学品在结构上与氨基酸酪氨酸非常相似,而酪氨酸是黑色素合成的组成部分,当试图将化学品转化为黑色素时,会诱导黑素细胞内的细胞应激途径。此外,免疫系统内的随机事件可能导致白癜风的发生,因为T细胞受体和抗体是通过现有基因的随机重组产生的。因此,在同卵双胞胎中发现的一组遗传因素可能通过随机事件导致非常不同的免疫反应。因此,遗传易感性、环境暴露和随机事件的组合会增加患白癜风的风险。

节段型白癜风

节段型白癜风是白癜风的一个亚型,表面为单侧分布。历史上,节段型白癜风被误称为 「皮节型白癜风」。然而,节段型白癜风沿着单一的皮节,经常涉及多个皮节,甚至与皮节垂直分布,表明这种疾病与单一神经无关。许多人认为节段型白癜风可能有一个独立的和不同的发病机制,推测神经可能在这一亚型的疾病中起作用。然而,最近的研究揭示了导致节段性白癜风的机制,表明也是由自身免疫导致的。

体细胞镶嵌在节段型白癜风的发病机制中可能有重要作用。当在发育过程中子宫内出现的突变产生了两个遗传上不同的细胞群时,就会发生体细胞镶嵌现象(详见白癜风发病机制和分类新进展)。体细胞镶嵌理论认为,体细胞突变通过诱导黑素细胞应激或增加黑素细胞特异性标志物的表达而产生易感黑素细胞,然后成为自身免疫攻击的目标。这些黑素细胞在发育过程中向腹侧迁移而不越过中线,可能导致疾病的单侧分布,这是节段型白癜风的特征。需要进一步的研究证实这一假设。

假说影响研究问题和结果解释

针对疾病发病机制的假说会影响实验设计以及数据解释,这对理解疾病的进展有好处也有坏处,因为这种自然的偏见可以使研究更加集中,导致加速发现,或者在一个狭窄的框架内对数据解释产生负面影响。在某些方面,「神经假说」 已经做到了这一点。多年来节段型白癜风的特征性单侧性质被误解为神经系统的参与其中,尽管皮损根本不遵循特定的神经支配模式。此外,白癜风患者血液和尿液中儿茶酚胺的升高被解释为支持神经假说,认为这些儿茶酚胺来自功能失调的神经。另一种解释是,儿茶酚胺的增加是黑素细胞破坏的产物。这种解释导致研究观察到黑素细胞也产生儿茶酚胺,从而提供了关于疾病期间黑素细胞生物学的新见解,并进一步驳斥了神经假说。在探索儿茶酚胺存在和神经定位的两个假设时,讨论和新的解释有助于将注意力集中在更有前景的发病机制上。

突出不同数据解释驱动实验方法的另一个例子是观察到免疫细胞浸润白癜风皮损。免疫组化研究显示,在白癜风皮损的上层真皮和表皮内有浸润的免疫细胞。然后发现这些免疫浸润主要是CD8+T细胞和巨噬细胞,它们位于濒临死亡的黑素细胞附近。一些人将这些免疫细胞解释为黑色素细胞变性后的简单「清理」,这导致了对巨噬细胞清除碎片在促进色素沉着中的作用的探索。另外,研究人员假设免疫浸润到表皮支持对黑素细胞的直接自身免疫攻击。这导致了对浸润性T细胞进一步表征分析,在白癜风患者的血液循环中,表达皮肤归宿受体皮肤白细胞相关抗原(CLA)的黑素细胞特异性CD8+T细胞的频率更高。对直接从病变皮肤中分离出来的T细胞的进一步研究表明,细胞毒性CD8+T细胞选择性地杀死黑素细胞,进一步验证了自身免疫理论。 

白癜风患者的黑素细胞中观察到热休克蛋白(HSPs)的产生增加。在退行性理论的背景下,对这一数据的一种解释是,HSPs的升高仅仅是黑素细胞在调节ROS产生方面的内在缺陷导致的应激增加。这导致了对正常细胞过程中和环境压力下的黑素细胞ROS和HSP产生的探索。另一种解释是,黑素细胞产生的HSP的增加作为危险信号,诱发炎症,导致自身免疫。化学药物诱导的白癜风,HSP70i在人类黑素细胞中升高,具有激活皮肤树突状细胞的能力,并且在小鼠模型中诱导白癜风需要HSP70i。 

事实上,两种可能性都可能是真的。调控ROS产生的黑素细胞内在缺陷可能在激活自身免疫方面发挥作用。内质网(ER)应激和ROS产生的相互作用与多种自身免疫性疾病的发生有关,包括白癜风。白癜风皮肤内的黑素细胞显示出氧化和ER应激的迹象,包括ROS升高,ER扩张,以及与UPR激活一致的基因表达,包括转录因子X-box蛋白1(XBP1),参与先天免疫细胞招募的细胞因子。白癜风诱导酚诱导黑色素细胞中XBP1的表达,提供了黑素细胞氧化和ER压力与免疫反应之间的可行联系。此外,黑素细胞内的这些应激途径导致HSPs的产生,以帮助减轻这种应激,然后HSP从黑素细胞分泌或在细胞死亡期间释放,通过TLR和其他PRR发出信号,激活免疫应答。通过互补的方法探索多种假说,如黑素细胞应激、先天性免疫激活和适应性自身免疫,将更好地理解白癜风发病过程中复杂的细胞相互作用和机制。

未来研究中解决现有假说

为了进一步探索现有的假说并更好地理解它们如何相互作用导致白癜风,需要对病变皮肤、非病变皮肤和健康皮肤进行遗传和功能分析。追踪黑素细胞系内的突变,将审视体细胞嵌合的发展和进展。进行单细胞RNA测序和功能基因组学技术,如用测序检测转座酶可及的染色质(Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing,ATAC-seq),可以指导功能研究,解决在系谱追踪中发现的突变,以确定它们对黑素细胞的稳态和功能的直接作用。

遗传研究的结果已经启动了许多实验。由于许多GWAS的基因同时存在于黑素细胞和免疫相关基因中,因此已确定的基因组风险等位基因指导了针对退行性和自身免疫理论的研究。剖析黑色素细胞内固有途径的研究提供了关于应激反应、ROS产生、代谢和粘附的见解。这些见解导致了一些有待回答的新问题,如了解黑素细胞和炎症之间如何相互影响的。例如,未来的研究可能会剖析黑素细胞的应激和炎症在疾病的开始和发展过程中如何相互影响。应激的黑素细胞可能会诱发局部炎症,继而引发并维持白癜风的自身免疫。炎症也可能是黑素细胞的应激源,由于白癜风患者的黑素细胞有缺陷,这种应激可能会进一步削弱黑素细胞,加剧自身免疫性疾病。 

此外,应继续研究炎症和黑素细胞粘附的相互作用。皮肤炎症可能会减少黑素细胞的粘附,或者失去粘附的黑素细胞可能会引发炎症并打破免疫耐受。这些问题没有答案的原因之一是,在细胞培养中不易研究细胞的相互作用,多数细胞培养缺少三维(3D)组织内相互作用。三维皮肤模型和动物模型可以成为探索这些问题的有用工具。这些模型也将有助于确定复杂的、多细胞的相互作用,这也是皮肤内自身免疫的特点。未解决的问题包括:自身免疫性黑素细胞的杀伤机制、抑制或预防疾病的耐受机制,以及除了自发的CD8+T细胞外,其他免疫细胞是否有助于黑素细胞的死亡。

对了解这些相互作用的兴趣支持了转化研究工具的进步和利用,如流式细胞仪、细胞分选和活体成像。随着这些技术的发展,探索这些细胞相互作用的机会将扩大。

白癜风研究的转化工具

Rubio等人将转化研究定义为基础研究、临床研究和人口研究的融合,这些研究不断地相互促进。转化研究的多方向性是有利的,因为它将模型系统中的机制研究与人体组织的临床观察和研究结合起来。因此,转化研究利用了基础和临床方法的优点,了解疾病的机制,同时保持生理学的相关性(图3)。
 

图3.白癜风转化研究工具

 图3.白癜风转化研究工具。白癜风在转化研究中具有独特的地位,因为有多种人类皮肤样本的收集技术,如剃须、环钻和吸水泡活检。这些活体组织可用于识别和描述单细胞水平的细胞群,如流式细胞仪和单细胞RNA测序技术。动物模型可用于研究启动因素和适应性免疫反应,以及像三维皮肤模型这样的细胞培养技术,这些模型对于阐明白癜风发病过程中的机制非常有用。

白癜风独特地适合于转化研究,因为它在人群中的发病率很高,有机会对疾病的发展进行视觉评估,而且可以随时可获取组织。与其他器官相比,获取患者皮肤活检创伤性较小。组织样本对于了解人类疾病的发病机制至关重要,因为其他来源的样本,如血液,充其量只是组织中致病因素的稀释版,最坏的情况是可能耗尽了致病因素。

用于皮肤取样的传统方法如环钻或刮薄层皮片法,可获取小块的组织进行分析。这些活体组织可以用组织学、免疫组织化学和免疫荧光法进行分析,以确定蛋白质的表达,从而获得表明细胞之间空间关系的位置信息。均质化组织可以进行RNA或蛋白质定量;然而,这消除了关于单个细胞或其在组织内位置的信息。固体组织可以被酶解以获得单细胞,用于单细胞分析,如流式细胞仪、RNA测序和其他。缺点有疼痛、需要麻醉、取样部位的疤痕,以及在某些情况下需要缝合。此外,浸润在白癜风皮损中的免疫细胞可能难以分离,因为它们经常出现在皮损周围的位置,即皮损边界以外的地方。这是因为这些细胞通过皮肤从皮损中心向外迁移,而黑素细胞的脱失需要表皮的更替才能在临床上观察到,所以真正的皮损边缘位于可见白斑之外。

1964年,Kiistala和Mustakallio首次吸疱法分离表皮和真皮。最初疱皮用来获取培养用的细胞,量化表皮上的细菌,并研究表皮的渗透性和生化特。各种皮肤病状态下水疱形成的时间也可用于对皮肤病及其严重程度进行分类,如寻常性天疱疮这样的水泡病。疱液可分析皮肤中的免疫细胞,如过敏性炎症期间的细胞招募,发疱后数天内免疫细胞可进入疱液。后来,发疱法用于表皮移植,治疗稳定的白癜风。最近,这种技术已用于其他用处,以确定细胞群、可溶性受体的蛋白水平以及分泌的生长因子和细胞因子。

发疱法创伤小,无痛苦,一般不留疤痕,不需要麻醉或缝合。它是通过抽吸负压来完成的,通常还加上加热。虽然单次环钻活检可收集4-6毫米的皮肤,但发疱法可获得更多的细胞数,每个受试者可提供多个水疱。然而,水疱无皮肤的结构,还可能会遗漏更深层真皮的细胞和组织液。由于白癜风由基底表皮的黑色素细胞破坏组成,所以发疱法非常适合于白癜风的转化研究。

 
有多种工具用于分析研究获得的组织样本(表1)。

 表1.白癜风转化研究工具的优缺点。

Translational tools to study vitiligo
TechniqueAdvantagesLimitations
Tissue acquision methods Punch BiopsyMaintains architecture; used for histology, IHC, IF, obtaining cells for cell cultureCan cause pain; scarring of a sample site; requires anesthesia and sutures or gelfoam
Shave BiopsyMaintains architecture; used for histology, IHC, IF. obtaining cells for cell cultureCan cause pain; scarring of a sample site; requires anesthesia
Suction BlisterLess invasive; not painful; non- scarring; collects more cells than conventional biopsies; provides interstitial skin fluid for analysis of soluble moleculesSamples epidermis and upper dermis; missing deeper, structural cells
Assay methods Flow cytometryIdentification and characterization of single cell protein expressionDependent on availability and quality of antibodies; limited number of proteins can be analyzed; lacks spatial information
Histology/ Immunohistochemistry/ Immunofluorescence Identifies immune infiltration and protein expression with spacial information is maintainedRequires optimization of staining and imaging; dependent on availability and quality of antibodies; limited number of proteins can be analyzed; less quantifiable than single-cell methods
Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq)Determine epigenetic changes between disease statesEpigenetic changes do not always lead to protein expression; lacks spatial information; expensive
Single cell RNA sequencing (scRNA-seq)Identification and characterization of single cell transcripts; does not require prior knowledge of genes of interest; no antibody optimizationNot all transcript changes reflect protein expression; lacks spatial information; expensive
MetabolomicsUnderstand changes in metabolic processes between disease statesUnable to identify which cells are producing which metabolites
Spatial mass spectrometry imagingIdentify which cell types are producing which proteins and metabolites with spatial resolutionNot as quantitative as standard metabolomics
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)Identify and measure soluble proteinsDoes not identify which cell types produce which proteins
Slide-seq/ RNA seqFISH+Transcriptomics with spatial informationFewer targets can be analyzed
2D cell cultureCan characterize primary cells, including cell-cell interactions through co-cultureMissing physiologically relevent conditions, including 3D interactions, air-tissue interface
3D cell cultureModeling of 3D skin envirionment and cellular interactions; may be useful for modeling autoimmune cell-cell interactionsMore complex methods; does not involve all cell interactions
Animal modelsModels in vivo disease; parallels to human disease; useful for complex cellular interactions and mechanistic studiesCostly to maintain; can be complex methods; some human pathways not present in animal models

单细胞RNA测序提供每个细胞的RNA表达谱,并鉴定异质细胞群中的稀有细胞。用测序检测转座酶可及的染色质(ATAC-seq)是一种评估全基因组染色质可及性的技术,是用于检测基因组染色质可及性的分子生物学手段。

不能用传统的活检方法获得的间质,可以用来分析可能有助于疾病发病机制的可溶性因素。例如,我们使用ELISA确定CXCL9是白癜风皮损中疾病活动的一个敏感和特异的生物标志物。已对皮肤间质进行了代谢组学研究,可用于了解非病变和病变皮肤内代谢过程的变化。虽然液体中的可溶性因素不能在单细胞水平上测量,但当结合scRNA-seq等单细胞技术相时,可以推断出路径,并提出新的假设。这些工具将为白癜风发病机制提供新的见解,并有可能快速发现白癜风所涉及的新途径和机制,希望能开发出更好的、持久的治疗方案。所有这些技术将为白癜风发病机制提供大量新的和令人兴奋的见解。虽然目前使用发疱法技术缺乏空间信息,但新兴的技术试图可弥补这一些,包括空间转录组学,如Slide-seq和RNA seqFISH+,以及空间质谱成像。

所有活检技术都可以分离出细胞进行培养。虽然健康的黑素细胞可以培养,但来自白癜风病变的黑素细胞很难在体外培养,因为它们的生长滞后时间很长,而且不能传代。在20世纪90年代初,细胞培养技术得到改进,通过添加生长因子,如成纤维细胞生长因子(bFGF)、12-肉豆蔻酸13-醋酸酯(PMA)和牛脑垂体提取物(BPE),使健康和白癜风黑素细胞都能得到培养。然而,二维细胞培养中可以研究的东西是有限性的,因此,在体外用三维皮肤培养可能有助于进一步剖析自身免疫的机制。

转化研究涵盖了广泛的实验设计。虽然许多人只认为包含人类样本和临床研究的实验是转化性的,但其他人认为与人类疾病平行的动物模型也是转化性工作。在使用病人样本工作时,很容易认识到对病人的直接影响,但这些研究在这种情况下往往缺乏机制上的洞察力,而基础研究更适合解决这个问题。因此,动物模型的开发和使用有助于为临床观察增加机制上的理解。Essien和Harris对白癜风的动物模型进行了广泛的综述。

转化研究的经验教训

利用转化方法研究白癜风的悠久历史使我们能够对疾病的发病机制有一个更完整的了解,而这在针对较少的组织的疾病中更难实现。转化研究是了解疾病机制的巨大财富,然后可以促进有希望的新疗法的发展(图4)。例如,患者的活检显示,有大量的黑色素细胞特异性CD8+T细胞浸润皮肤,产生IFNγ和IFNγ诱导基因,并表达NKG2D。一项研究报告了皮损内IFN的表达,使用CXCL9和MxA作为IFN诱导的代用标记,然而这些也可以由IFNγ诱导。小鼠研究发现I型IFN在白癜风中无作用,因为IFNα受体(IFNaR)敲除的小鼠仍然发展为白癜风,程度相同。因此,虽然IFNγ在白癜风发病机制中显然起着重要作用,但仍不清楚其他IFN是否对疾病有贡献。
图4. 转化研究揭示白癜风的发病机制
图4. 转化研究揭示白癜风的发病机制。 简单介绍一下目前对白癜风发病机制的认识。自身活性的CD8+T细胞被角质细胞产生的CXCL10招募到皮肤中,并杀死黑素细胞。这些细胞转化为常驻的记忆性T细胞,维持白癜风并需要皮肤中的IL-15信号传导。JAKi和IL15i可能是治疗白癜风的有效方法,目前正在进行临床试验。仍然存在的一些问题,如黑素细胞异常如何启动自身免疫,CD8+T细胞杀死黑素细胞的机制,Tregs如何抑制疾病,以及代谢的变化如何影响疾病活动。现有的和正在开发的转化工具将有助于回答这些和其他问题。

白癜风皮损内高水平表达CXCR3,而且CXCR3配体的表达是白癜风皮损的特征。小鼠模型数据显示,CXCR3和CXCR3配体在小鼠模型的病变皮肤内表达,而且在疾病进展和维持期间需要招募T细胞。小鼠模型也使我们有可能确定,角质细胞对T细胞产生的IFNγ有反应,并分泌CXCL10来招募黑色素细胞反应性的CD8+T细胞到皮肤上。这些发现为测试阻断IFNγ信号的JAK抑制剂作为白癜风的治疗方法提供了理论基础,并最终导致了一项成功的2期临床试验,以测试局部使用Ruxolitinib作为该疾病的新疗法。

然而,传统的治疗方法,甚至JAK抑制剂似乎都不能在治疗后提供持久的反应,因为一旦停止治疗,疾病就会在以前的皮损内复发。转化研究显示,自体活性CD8+T细胞在白癜风皮损皮肤中形成组织常驻记忆细胞(Trem)。小鼠模型证实了Trem在白癜风皮损中的存在,并发现它们的作用是对停止治疗后疾病的维持和复发。其他研究确定,黑素细胞特异性的自体Trem需要IL-15,而靶向IL-15信号可以消除皮肤中的Trem,并导致小鼠的持久复色。IL-15的表达在白癜风皮损皮肤中升高,并可能由角质细胞的氧化应激诱发(151)。因此,靶向IL-15可能为白癜风提供一种持久的治疗选择,测试这一假设的临床试验即将开始。 详见:白癜风发病机制和治疗新进展

如上所述,HSP70i的表达增加已被报道在白癜风病变中,并激活皮肤树突状细胞,可使针对黑色素细胞的自体反应性T细胞得到激活。小鼠模型显示需要HSP70i来启动白癜风,当被抑制时,可预防疾病。此外,黑素细胞对氧化应激产生HSP70,这可能在黑素细胞的细胞应激和启动白癜风自身免疫的炎症之间提供一个联系。因此,黑素细胞应激可以通过靶向这一途径得到缓解,从而提供一个新的治疗机会。

当暴露于氧化应激时,WNT信号成分在黑色素细胞中的表达减少。作者继续证明,用化学WNT激动剂治疗可以促进白癜风皮肤的黑素细胞分化,这表明激活黑素细胞中的WNT信号可能会促进其再生。虽然该研究没有显示这种分化是否完全发展为成熟的功能性黑素细胞,但WNT信号在黑素细胞干细胞分化中至关重要,WNTs主要由角质细胞和黑素细胞分泌。此外,WNT信号通过β-catenin的可用性来调节E-cadherin,这是黑色素细胞的一个重要粘附分子。白癜风皮肤上的黑色素细胞的E-cadherin表达减少。这些研究共同表明,WNT信号的减少可能会损害黑色素细胞的粘附。此外,1型细胞因子IFNγ和TNFα通过抑制黑素细胞E-cadherin的表达和诱导角质细胞释放蛋白酶MMP-9而损害黑素细胞粘附于表皮。MMP-9可裂解E-cadherin复合物,从而导致黑色素细胞从表皮脱落。当用JAK抑制剂抑制1型细胞因子,或抑制MMP-9的活性时,更少的黑色素细胞脱落。因此,像JAK抑制剂这样的抗炎治疗也可能稳定黑色素细胞,如果与WNT激动剂或脱离抑制剂一起使用,促进黑色素细胞的再生和维持,有可能变得更加持久。

有些人提出,激活免疫检查点抑制剂,即在T细胞表面表达的受体,可负向调节白癜风,可能是白癜风的有效治疗靶点。阻断皮肤淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)治疗黑色素瘤会诱发和加重白癜风,大概是通过消除防止这些细胞自身免疫性激活的负调控。据报道,白癜风患者的全血中CTLA-4 mRNA表达减少,CD8+T细胞上的PD-1表达与疾病活动呈正相关,表明活化程度增加。PD-L1抑制细胞因子的产生,并与维持外周耐受有关。Miao等人报告说,向白癜风小鼠模型注射PD-L1融合蛋白导致疾病严重程度降低,Treg与效应T细胞比率增加。然而,PD-1也是T细胞衰竭的标志,据报道,白癜风患者外周血中的调节性T细胞也有PD-1的上调。理论上,PD-L1可能会对Tregs进行负向调节,与效应性T细胞类似,然而在体外中和PD-L1导致从慢性感染的HCV患者中分离出的人类Tregs的扩张。靶向这些或其他负刺激分子可能会限制自体CD8+T细胞的活性,这可能会使Tregs恢复,以恢复耐受性,但还需要进一步调查。

最近,基于Treg的治疗方法有了进展。在健康受试者中,Tregs似乎能积极预防白癜风,而在患病者中则可能效果不佳。白癜风患者的Tregs可能存在缺陷,尽管这些缺陷不一定是在Treg总数、迁移到皮肤的能力,还是抑制功能方面。扩增Tregs和采用这些细胞转移到病人身上,在缓解一些自身免疫性疾病和移植方面有很好的效果。据报道,在小鼠研究中,选择性扩增抗原特异性Tregs比多克隆Tregs更能控制炎症。嵌合抗原受体T细胞(CAR)-Tregs正在被开发为自身免疫和GVHD的治疗方案。CAR-Tregs是一个更稳定的、抗原特异性的Treg群体,可以被设计成迁移到炎症部位,然而需要更多的改进,因为脱靶免疫抑制会导致对感染和癌症发展的易感性。采用转移Tregs到一个自发性白癜风小鼠模型中,减少了疾病的发生。此外,用雷帕霉素治疗这些小鼠限制了疾病的发展并增加了循环Tregs的数量。进一步的调查对于优化这些疗法和减少白癜风治疗的风险将是非常重要的。

利用白癜风了解器官特异性自身免疫

通过白癜风的转化研究取得的进展可能会促进其他疾病的研究,因为这些疾病不太常见和/或因为转化研究的目标组织不太容易获得,所以更难研究。CD8+T细胞针对单一细胞类型导致该细胞类型丧失的疾病可能与白癜风有着类似的发病机制。这方面的例子包括胰腺内的1型糖尿病(T1D)、甲状腺内的桥本甲状腺炎、肾上腺皮质内的阿狄森氏病和大脑内的多发性硬化症(MS)。为了支持这一假说,GWA研究揭示了常见的风险SNPs。此外,研究表明CD8+T细胞在桥本甲状腺炎、多发性硬化症和阿狄森氏病中与白癜风相似,以及IFN-γ趋化因子轴在发病过程中的重要作用。IFN-γ和CXCL10在T1D中表达以招募淋巴细胞,在阿狄森氏病中自体反应细胞产生IFN-γ,IFN-γ水平与桥本甲状腺炎的疾病严重程度正相关。IFN-γ也参与了多发性硬化症,尽管它的作用仍未被完全理解。此外,在NOD小鼠模型中靶向IL-15可以减少疾病的严重程度,这表明IL-15可能在T1D的发病机制中起作用。因此,白癜风的发病机制可以作为这些疾病的指南,以发起更有针对性的调查,以及重新利用治疗方法。缩小潜在的调查领域有助于加快对这些自身免疫性疾病发病机制的理解。

结论

白癜风是一种器官特异性的自身免疫性疾病,会导致白色斑块状的皮肤脱色。自40多年前现代白癜风研究开始以来,转化工作一直处于白癜风研究的前沿,因为可以简单、无创地收集患者的皮肤样本。这些观察结果导致了临床研究和一项成功的临床试验,很可能改变我们在临床上管理病人的方式。除了样本收集之外,研究人员之间的讨论、合作和开放性的考虑使白癜风成为对自身免疫性疾病理解最深刻的疾病之一。针对退行性和自身免疫性发病理论的独立、平行研究,通过防止实验重点的狭窄,使我们对白癜风的发病机制有了更广泛的了解。这不仅有助于我们对白癜风的理解,而且还为研究一般的器官特异性自身免疫提供了一个宝贵的平台。有关白癜风的知识可能对那些研究类似的自身免疫性疾病的人有益,因为他们不能随时获得组织进行转化研究。随着更多的讨论、合作和技术的不断进步,我们对白癜风和其他自身免疫性疾病的理解将得到改善。这些进展将不断地应用于新的治疗方法的开发,以帮助患者。

via: Katz EL. Translational Research in Vitiligo. Front Immunol. 2021

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